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Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 10263 (2022) Citer cet article

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Le nombre croissant de traceurs de tomographie par émission de positrons (TEP) développés pour faciliter le développement de médicaments et créer de nouveaux diagnostics a conduit à un besoin accru de développement et d'optimisation de la radiosynthèse. Les instruments de radiosynthèse actuels sont conçus pour produire des lots cliniques à grande échelle et se limitent souvent à effectuer une seule synthèse avant de devoir être décontaminés en attendant la désintégration des radionucléides, suivi d'un nettoyage en profondeur ou de l'élimination des composants du synthétiseur. Bien qu'avec certains radiosynthèses il soit possible d'effectuer quelques radiosynthèses séquentielles en une journée, aucune ne permet des radiosynthèses parallèles. Le débit d'une ou de quelques expériences par jour n'est pas bien adapté aux expériences d'optimisation rapides. Pour lutter contre ces limitations, nous tirons parti des avantages de la radiochimie des gouttelettes pour créer une nouvelle plate-forme d'expérimentation à haut débit en radiochimie. Ce système contient un réseau de 4 éléments chauffants, chacun utilisé pour chauffer un ensemble de 16 réactions sur une petite puce, permettant 64 réactions parallèles pour l'optimisation rapide des conditions à n'importe quelle étape d'un processus de radiosynthèse en plusieurs étapes. À titre d'exemples, nous étudions les synthèses de plusieurs radiopharmaceutiques marqués au 18F ([18F]Flumazenil, [18F]PBR06, [18F]Fallypride et [18F]FEPPA), réalisant > 800 expériences pour explorer l'influence de paramètres tels que le type de base, quantité de base, quantité de précurseur, solvant, température de réaction et temps de réaction. Les expériences ont été réalisées en seulement 15 jours d'expérience, et le petit volume (~ 10 μL par rapport à l'échelle de ~ 1 mL des instruments conventionnels) a consommé ~ 100 × moins de précurseur par point de données. Cette nouvelle méthode ouvre la voie à des études d'optimisation plus complètes en radiochimie et raccourcit considérablement les délais de développement des traceurs TEP.

Le domaine de l'imagerie moléculaire a créé la tomographie par émission de positrons (TEP) et la tomographie d'émission monophotonique (SPECT)1 pour la visualisation et la quantification des processus biochimiques chez les sujets vivants. L'utilisation de molécules biologiquement actives marquées avec des radionucléides à vie courte permet d'effectuer une telle imagerie de manière non invasive au niveau du corps entier. La TEP est utilisée dans un large éventail de recherches sur les petits animaux et les humains pour aider à comprendre les voies de la maladie2,3, mesurer la pharmacocinétique, confirmer les effets biologiques de nouveaux composés thérapeutiques4,5, surveiller la progression de la maladie ou surveiller la réponse au traitement6,7,8 . Les radio-isotopes couramment utilisés en PET comprennent le C-11 (t1/2 = 20,4 min), le F-18 (t1/2 = 109,8 min) et le Ga-68 (t1/2 = 67,7 min), entre autres.

Les produits radiopharmaceutiques sont généralement préparés à l'aide de synthétiseurs automatisés pour limiter l'exposition du personnel aux rayonnements et améliorer la reproductibilité9. La préparation d'un lot d'un radiopharmaceutique est coûteuse en raison du coût élevé du radiosynthétiseur, de la protection contre les rayonnements, des réactifs, du radio-isotope et du personnel qualifié. Ces coûts sont fortement démultipliés pour les études d'optimisation, qui nécessitent de nombreuses synthèses à réaliser dans des conditions différentes. De plus, la plupart des radiosynthétiseurs sont conçus pour une ou quelques radiosynthèses consécutives par jour, de sorte que les études d'optimisation peuvent prendre des semaines ou des mois, ce qui augmente encore le coût de la main-d'œuvre, l'utilisation des ressources et le coût des radio-isotopes.

Récemment, plusieurs approches ont été décrites pour améliorer considérablement le débit des expériences de radiochimie. Zhang et al. ont effectué des réactions sans radioactivité mais ont imité les concentrations ultra-faibles associées aux radionucléides et ont tiré parti de la haute sensibilité de l'analyse LC-MS/MS pour évaluer le rendement du produit10. Bien que le fait d'éviter l'utilisation de la radioactivité ait augmenté le débit des expériences, le recours aux volumes de réaction conventionnels a encore consommé beaucoup de temps et de réactifs pour obtenir chaque point de données. Comme alternative, les plates-formes microfluidiques et les techniques de radiochimie miniaturisées offrent des voies prometteuses pour augmenter le débit tout en minimisant la consommation de réactifs11,12,13,14 en empruntant des concepts d'expérimentation à haut débit en chimie organique15,16,17. Plusieurs groupes ont montré que des dizaines de réactions radiochimiques à petite échelle (c'est-à-dire 10 s de µL chacune, par rapport aux ~ 0,5 à 2,0 mL utilisés dans les configurations conventionnelles) peuvent être effectuées séquentiellement à l'aide de plates-formes de réacteur capillaire à chimie en flux avec des produits bruts collectés et analysés hors ligne18 ,19,20,21. Alors que des paramètres tels que la température et les débits de réactifs peuvent être facilement étudiés à haut débit, d'autres, tels que le solvant de réaction ou les conditions de séchage/activation du [18F]fluorure, ne le peuvent pas. Une autre plate-forme d'optimisation a utilisé une puce microfluidique de polydiméthylsiloxane (PDMS) pour préparer des lots ultra-petits (~ 100 nL chacun) pour le dépistage des conditions aqueuses de radiomarquage des protéines, mais a été limitée à des ratios de réactifs variables et à pH22,23.

Des réactions basées sur des flacons de petit volume ont également été utilisées pour l'optimisation24 et permettent d'étudier un plus large éventail de paramètres. Récemment, Laube et al. ont rapporté l'utilisation de blocs chauffants à plusieurs flacons pour effectuer jusqu'à ~ 50 radiofluorations par jour, chacune impliquant le séchage d'une petite aliquote de [18F]fluorure éluée d'une cartouche QMA, suivie d'une réaction à l'échelle de 25 à 50 µL25. Tout en démontrant le parallélisme et la faible consommation de réactifs, cette technique nécessitait une manipulation manuelle importante des flacons, y compris l'installation et le retrait des bouchons des flacons. De plus, il est bien connu que les caractéristiques de chauffage détaillées du système sont essentielles à prendre en compte26, et après optimisation dans de petits flacons, les conditions peuvent devoir être adaptées à un synthétiseur conventionnel pour une production automatisée de routine.

Notre groupe a récemment lancé une plate-forme microfluidique, dans laquelle les réactions sont effectuées à une échelle encore plus petite (c'est-à-dire 1 à 10 µL) dans des gouttelettes confinées dans des pièges à tension superficielle modelés sur une surface27. Dans ces conditions, les réactions de gouttelettes ont généralement des rendements comparables aux méthodes conventionnelles, mais permettent un temps de synthèse plus court et jusqu'à ~ 100 fois moins de consommation de réactifs par réaction28,29,30. Il convient de noter en particulier qu'après optimisation dans des conditions de faible activité, une production à plus grande échelle (par exemple une ou quelques doses cliniques) peut être obtenue dans des conditions identiques à l'aide d'un radiosynthétiseur automatisé à base de gouttelettes31,32 par une simple augmentation de l'activité de départ. Pour augmenter le débit, nous avons créé des puces avec plusieurs sites de réaction pour effectuer jusqu'à 16 synthèses à base de gouttelettes en parallèle, toutes avec la même température et le même temps de réaction mais avec des volumes ou des concentrations variables de réactifs33. Une étude préliminaire a montré la possibilité d'optimiser plusieurs paramètres dans la synthèse de [18F]Fallypride, notamment la quantité de base, la concentration du précurseur et le volume de réaction des gouttelettes. Dans cet article, le débit et la flexibilité sont encore augmentés en introduisant un réseau de 4 éléments chauffants indépendants, permettant le fonctionnement de 4 puces en parallèle. Cette plate-forme améliorée permet l'exploration parallèle de variables de réaction supplémentaires (température et temps de réaction) qui ne peuvent pas être étudiées facilement avec une seule puce à la fois.

Des réseaux de réactions ont été réalisés sous forme de gouttelettes sur des "puces" de silicium recouvertes de téflon de 25, 0 × 27, 5 mm2 (Fig. 1A). Chaque réaction a été confinée à un site hydrophile circulaire de 3 mm de diamètre (réalisé en gravant le revêtement de Téflon) qui agit comme un piège à tension superficielle. Les détails de la fabrication de la puce ont déjà été rapportés33.

Appareil de réaction à haut débit. (A) Photographie de puce multi-réaction. (B) Modèle CAO montrant les composants de la plate-forme. (C) Vue en coupe de la plate-forme multi-chauffage montrant le chemin du refroidissement à air forcé. (D) Photographie de la plate-forme (d'en haut) avec des puces multi-réaction installées.

Plusieurs puces ont été utilisées en parallèle à l'aide d'une plate-forme à quatre éléments chauffants sur mesure (Fig. 1B-D). Pour assurer la radioprotection, la plate-forme fonctionnait à l'intérieur d'une cellule chaude, mais le système de contrôle pouvait être placé à l'extérieur pour minimiser l'encombrement. La plate-forme comprenait quatre éléments chauffants en céramique de 25 x 25 mm2 collés à l'époxy sur un cadre thermiquement isolant usiné CNC à partir d'un composite de silicate de calcium, qui était à son tour fixé au sommet d'une pièce en nylon imprimée en 3D pour diriger l'air de refroidissement vers chaque élément chauffant de un jeu de quatre ventilateurs 36 mm 12 V DC (Sect. Supplémentaire 1). Des simulations thermiques ont été effectuées pour déterminer un espacement approprié des radiateurs afin d'éviter la diaphonie thermique des radiateurs voisins (Sect. 2 supplémentaire). Les puces ont été fixées aux éléments chauffants avec une fine couche de pâte thermique.

Chaque réchauffeur (et ventilateur) était contrôlé indépendamment, permettant à l'ensemble des réactions sur chaque puce multi-réaction d'être effectuée à une température ou une durée unique (Sect. supplémentaire 1). Pour chaque élément chauffant, le signal du thermocouple de type K intégré a été amplifié et connecté à une entrée analogique d'un module d'acquisition de données (DAQ). Les éléments chauffants étaient alimentés en 120 VAC commutés par un relais à semi-conducteurs piloté par une sortie numérique du DAQ à l'aide d'un contrôleur marche-arrêt implémenté dans LabView (National Instruments). Après le temps de chauffage souhaité, le refroidissement à air forcé a été activé à l'aide d'une sortie numérique du DAQ pour alimenter le ventilateur correspondant via un circuit de commande Darlington.

Après avoir calibré les appareils de chauffage (Sect. supplémentaire 3), la stabilité de la température a été évaluée en surveillant le thermocouple intégré par rapport au temps (Figure supplémentaire S6). À chaque point de consigne testé, le chauffage n'a pris que ~ 5 s et la température a présenté une fluctuation < 1 ° C une fois stabilisée (tableau supplémentaire S1). Le refroidissement à air forcé à 30 °C a pris ~ 3 min à partir de 140 °C, ~ 2,5 min à partir de 100 °C et ~ 1,2 min à partir de 50 °C. De plus, la distribution spatiale de la température de chaque élément chauffant a été visualisée par imagerie thermique. Tous les appareils de chauffage présentaient une température de surface uniforme (Figures supplémentaires S7, S8 et Tableau S2), sauf près des bords (où un écart> 2% par rapport à la moyenne a été observé). Dans tous les cas, l'étendue de cette zone inutilisable était limitée à < 1,5 mm sur chaque bord de l'élément chauffant. Ainsi, les puces multi-réactions ont été conçues avec une limite inutilisée de 2,4 mm, garantissant que les 16 sites de réaction étaient entièrement situés dans la partie uniforme de la surface de l'élément chauffant (Figure supplémentaire S9)33. Une étude précédente a confirmé la cohérence des réactions aux différents sites de la puce et le degré négligeable de contamination croisée d'un site à l'autre33.

Avec la plate-forme, jusqu'à 64 synthèses radiochimiques pourraient être effectuées en parallèle, chaque réaction utilisant ~ 100 × moins de réactifs que les approches conventionnelles. Étant donné que toutes les étapes, y compris le séchage du fluorure [18F], sont effectuées sur puce, les conditions utilisées dans n'importe quelle partie de la synthèse peuvent être explorées à haut débit.

Nous avons utilisé cette nouvelle plateforme pour effectuer des études approfondies des synthèses de plusieurs traceurs TEP cliniquement pertinents : [18F]Flumazenil [18F]FMZ), [18F]PBR06, [18F]Fallypride et [18F]FEPPA.

Pour chaque produit radiopharmaceutique, une vaste série d'expériences a été réalisée pour comparer l'influence de différentes conditions de réaction liées au séchage du [18F]fluorure et à la réaction de radiofluoration. Nos objectifs étaient de mieux comprendre l'influence de divers paramètres de réaction et de développer des protocoles de synthèse à micro-échelle efficaces pour ces traceurs. Les conditions initiales de réaction des gouttelettes ont été déterminées essentiellement en réduisant les volumes d'environ 100 × par rapport aux protocoles conventionnels à grande échelle. En général, les expériences ont été réalisées par lots de 64 réactions simultanées (4 puces × 16 réactions chacune), explorant 16 conditions différentes, chacune avec n = 4 répétitions.

La figure 2 illustre le schéma de synthèse pour chaque traceur et le processus généralisé pour un ensemble de 16 réactions. Sur chaque site, une gouttelette de 8 μL de solution mère de fluorure [18F] (fluorure [18F] mélangé avec la quantité et le type souhaités de base et de catalyseur de transfert de phase) est ajoutée au site de réaction et séchée. (Bien que les paramètres de séchage pour éliminer l'eau résiduelle puissent également être étudiés, le séchage a été effectué pendant 1 min à 105 ° C dans toutes les expériences.) Ensuite, 8 µL de solution de précurseur (6 µL pour [18F]Fallypride) avec la concentration et la réaction souhaitées le solvant est ajouté au résidu séché et mis à réagir à température élevée pendant la durée souhaitée. Le volume de réaction pourrait également être étudié en tant que paramètre mais n'a pas été exploré ici. Une fois la réaction terminée, le produit brut est récupéré. Bien que les paramètres de collecte puissent être optimisés pour minimiser l'activité résiduelle sur la puce, nous avons effectué la collecte de produits dans tous les cas en distribuant 10 μL de solution de collecte sur le site de réaction et en aspirant le volume et en répétant ces étapes 4 × pour un total de 40 μL de collecté produit brut. La performance de la réaction a été déterminée en mesurant à la fois la conversion du [18F]fluorure en produit par radio-TLC, ainsi que l'activité récupérée de chaque réaction (par rapport à l'activité de départ, c'est-à-dire l'efficacité de la collecte) pour déterminer un rendement radiochimique brut global (RCY ). L'analyse TLC a été réalisée à l'aide de méthodes multipistes récemment rapportées avec 8 échantillons par plaque34.

Processus d'optimisation. (A) Schéma de radiosynthèse du [18F] Flumazénil. (B) Synthèse de [18F]PBR06. (C) Synthèse de [18F]Fallypride. (D) Synthèse de [18F]FEPPA. (E) Procédure expérimentale pour effectuer des radiosynthèses parallèles à l'aide d'une puce de microgouttelettes multi-réaction (4 × 4). Les concentrations, les solvants et les volumes peuvent varier d'un site à l'autre, et la température et le temps de chauffage peuvent varier d'une puce à l'autre. (F) Procédure d'analyse des performances de la réaction. Les activités des échantillons bruts collectés sont mesurées à l'aide d'un calibrateur de dose et comparées à l'activité de départ pour déterminer l'efficacité de la collecte. L'activité résiduelle sur la puce est analysée par imagerie Cerenkov. Les échantillons bruts sont analysés par radio-TLC pour déterminer l'efficacité de la fluoration.

Le [18F]flumazénil est utilisé pour quantifier les changements de densité des récepteurs GABAA associés à la maladie d'Alzheimer, à la schizophrénie, à la plasticité neuronale et aux processus sensoriels35. Nous nous sommes concentrés sur la voie du précurseur de nitromazénil disponible dans le commerce18,36,37,38,39,40, pour lequel les rendements isolés signalés sont de l'ordre de 8 à 30 %36,37,38,39,40. Bien que d'autres voies de synthèse aient conduit à des rendements plus élevés, elles n'ont pas été poursuivies ici en raison du manque de disponibilité commerciale du précurseur de tosylate de diaryliodonium41 ou de la très faible activité molaire (0,37 GBq/µmol [0,01 Ci/µmol]) de la méthode d'échange isotopique42 . Les études d'optimisation précédentes utilisant des approches à grande échelle et de chimie en flux (tableau 1) ont généralement comparé seulement quelques valeurs pour les paramètres étudiés et souvent avec peu ou pas de répétitions18,36,37,38,39,40. Tirant parti du débit accru de notre plate-forme, nous avons effectué une série d'expériences pour explorer des plages plus complètes de chaque paramètre avec une granularité plus fine (généralement 8 valeurs chacune) et plus de répétitions. Les paramètres explorés comprenaient : (i) la température de réaction, (ii) la quantité de base, (iii) la quantité de précurseur, (iv) le temps de réaction, (v) le solvant de réaction et (vi) le type de base et le catalyseur de transfert de phase. Les détails complets et les résultats de chaque série d'expériences peuvent être trouvés dans la section supplémentaire. 2. Étant donné que la plupart des publications rapportent l'utilisation des solvants N,N-diméthylformamide (DMF) et diméthylsulfoxyde (DMSO)18,38, les études que nous avons réalisées pour les paramètres i à iv ont été réalisées en utilisant chacun de ces solvants. Comme exemple de la façon dont chaque expérience a été configurée, la figure 3 montre comment quatre puces ont été utilisées pour explorer la température de réaction. La figure montre également les images de la radioactivité résiduelle sur les puces après synthèse, et les images Cerenkov des plaques TLC utilisées pour évaluer la conversion. Les calculs de performances résultants pour chaque condition sont tabulés dans le tableau supplémentaire S3 et les performances sont tracées sur la figure 4A. L'efficacité de la fluoration augmente fortement avec la température. Cependant, contrairement à d'autres réactions à base de gouttelettes, les pertes volatiles lors de la réaction de fluoration, ainsi que l'activité résiduelle collée à la puce après la collecte, ont entraîné une diminution de l'efficacité de la collecte avec l'augmentation de la température. (Généralement, la quantité de perte volatile dominait et était environ 15 à 10 × supérieure à la perte résiduelle.) Le RCY brut résultant présentait un comportement de pointe avec un maximum de 13,5 ± 0,6 (n = 4) à 200 ° C (avec DMF ). Conformément à ces tendances, Wong et al. ont trouvé que la température d'un réacteur à flux était un facteur essentiel avec une efficacité de fluoration passant de ~ 0% à 120 ° C à ~ 20% à 160 ° C en utilisant du DMF comme solvant, et de ~ 0% à ~ 5% en utilisant du DMSO18. Mandap et al., utilisant un réacteur à micro-ondes, ont également constaté que l'efficacité de la fluoration augmentait considérablement avec la température jusqu'à une valeur maximale, puis diminuait quelque peu à des températures plus élevées38.

Montage expérimental pour un lot d'expériences explorant l'influence de la température de réaction (8 valeurs) et du solvant (2 types) pour la synthèse du [18F]Flumazénil. (A) Attribution de 64 sites de réaction. La moitié des sites de réaction ont d'abord été utilisés pour explorer 4 températures différentes dans le premier ensemble de 32 réactions simultanées. Ensuite, l'autre moitié des sites a été utilisée pour les 4 températures restantes. (B) Les images Cerenkov montrent la distribution de l'activité résiduelle sur chaque puce après la collecte des produits bruts. Le signal de radioactivité est corrigé de la décroissance à un point temporel commun pour toutes les images. La réaction marquée d'un "X" n'a pas été analysée (par erreur, la gouttelette de précurseur n'a pas été ajoutée au site de réaction). (C) Images Cerenkov de plaques TLC développées (chacune contenant 8 échantillons) pour des réactions utilisant du DMSO comme solvant de réaction. (D) Échantillons bruts séparés en utilisant du DMF comme solvant de réaction. Les cercles en pointillés indiquent les retours sur investissement utilisés pour l'analyse. La flèche rouge en pointillés indique la direction du mouvement du solvant pendant le développement. Les lignes pointillées blanches représentent la limite de chaque plaque multi-échantillons.

Influence des paramètres de réaction sur les performances de la radiosynthèse des microgouttelettes de [18F]Flumazénil. Pour chaque paramètre, l'influence sur l'efficacité de la fluoration, l'efficacité de la collecte et le RCY brut sont tracés individuellement. (A) Effet de la température (et du solvant). Quantité de précurseur : 280 nmol. Volume de réaction : 8 µL. Quantité de base : 480 nmol. Temps de réaction : 2 min. (B) Effet de la quantité de base (et de solvant). Quantité de précurseur : 280 nmol. Volume de réaction : 8 µL. Température de réaction : 200°C. Temps de réaction : 2 min. (C) Effet de la concentration du précurseur (et du solvant). Volume de réaction : 8 µL. Quantité de base : 240 nmol. Temps de réaction : 2 min. Température de réaction 200°C. (D) Effet du temps de réaction (et du solvant). Quantité de précurseur : 280 nmol. Volume de réaction : 8 µL. Quantité de base : 240 nmol. Température de réaction : 200°C. (E) Effet du solvant de réaction. Quantité de précurseur : 280 nmol. Volume de réaction : 8 µL. Quantité de base : 240 nmol. Température de réaction : 200°C. Temps de réaction : 0,5 min. (F) Effet du type de base (et de solvant). Quantité de précurseur : 280 nmol. Volume de réaction : 8 µL. Quantité de base : 240 nmol. Température de réaction : 200°C. Temps de réaction : 0,5 min.

Nous devons souligner que généralement seule l'efficacité de la radiofluoration (telle que déterminée par radio-HPLC ou radio-TLC) et/ou le rendement radiochimique est rapporté dans les expériences d'optimisation, ce qui rend difficile de faire des comparaisons détaillées avec les réactions de gouttelettes. Signaler uniquement l'efficacité de la radiofluoration peut être trompeur car de nombreuses pertes potentielles (par exemple, les pertes volatiles ou l'activité résiduelle collée sur les flacons ou les tubes, qui peuvent être importantes43) ne sont pas prises en compte. Seul le rendement radiochimique rend compte des pertes, mais toutes les pertes (provenant de diverses étapes de synthèse ou de purification) sont regroupées. Des écarts importants ont été signalés entre la conversion radiochimique et le rendement radiochimique du [18F]flumazénil36,37,39. Par exemple, Vaulina et al. ont observé une efficacité de fluoration (TLC) de 25 % mais n'ont obtenu qu'un rendement isolé de 2 % après purification HPLC et formulation SPE, ou 9 % après purification/formulation à base de SPE36. Massaweh et al. ont constaté que malgré une efficacité de fluoration (TLC) de 27 à 35 %, le rendement isolé n'était que de 2 à 5 % 40, bien qu'il se soit amélioré à 15 à 20 % après l'optimisation de la phase mobile39. Bien que ces écarts puissent refléter des pertes élevées lors de l'étape de purification/formulation36, ces rapports ne contiennent pas suffisamment de détails ou de données pour exclure d'autres pertes (par exemple, activité résiduelle sur le récipient de réaction ou la tubulure, pertes volatiles, etc.)

La température a été fixée à 200 °C pour les expériences ultérieures. Avec l'augmentation de la quantité de base (Fig. 4B), nous avons observé que l'efficacité de la fluoration augmentait de près de zéro et plafonnait à une valeur maximale lorsque la quantité de base atteignait ~ 150–200 nmol. L'efficacité de la collecte a présenté un comportement inverse, et le RCY brut global pour le DMF (le solvant le plus performant) a présenté une forte augmentation, puis un plateau à partir d'environ 160 nmol de base. 240 nmol (où le RCY brut n'était que légèrement inférieur) a été sélectionné comme quantité optimale pour assurer la robustesse contre les erreurs de pipetage. L'étude de l'augmentation de la quantité de précurseur (Fig. 4C) a montré des augmentations rapides jusqu'à ~ 80 nmol, puis un plateau, pour l'efficacité de la fluoration, l'efficacité de la collecte et le RCY brut. Le RCY brut le plus élevé (avec le DMF, le solvant le plus performant) s'est produit à une quantité de précurseur de 280 nmol, qui a été sélectionnée comme condition optimale. Le fort impact de la quantité de précurseur en dessous du plateau est cohérent avec Mandap et al., qui ont rapporté une faible efficacité de fluoration (< 3 %, n = 1) pour 1 mg de précurseur dans du DMF à 160 °C, et des valeurs élevées (~ 30 % ) avec 2 à 8 mg de précurseur. Ryjikov et al. ont également trouvé des différences marquées dans l'efficacité de la fluoration dans les comparaisons par paires des quantités de précurseurs40. Malheureusement, le volume de réaction est donné sous forme de plage dans les deux articles, ce qui rend impossible la comparaison des valeurs de concentration. Dans de nombreuses réactions, le rapport base / précurseur est un paramètre pertinent et nous avons donc tracé les performances de la réaction en fonction de ce rapport dans la section supplémentaire. 5.4. Les ratios compris entre ~ 1 et 3 ont donné le RCY brut le plus élevé, avec une chute rapide pour les valeurs de ratio inférieures et une chute progressive pour les valeurs supérieures. Lors de l'exploration de l'augmentation du temps de réaction (Fig. 4D), l'efficacité de la fluoration a présenté une augmentation progressive et l'efficacité de la collecte a présenté une tendance inverse (principalement en raison de la perte d'activité volatile). Le RCY brut résultant dans du DMF (le solvant le plus performant) a présenté une diminution avec le temps, avec un maximum de 15,4 ± 0,9 % (n = 4) pour une réaction de 0,5 min. Bien que le temps de réaction n'ait pas été largement étudié dans la littérature, des temps plus longs semblaient améliorer les performances de synthèse dans des réacteurs fermés. Ryjikov et al. ont observé une augmentation de l'efficacité de la fluoration de 39 % (n = 1) à 80 % (n = 1) en augmentant le temps de 15 à 30 min40.

Compte tenu des pertes volatiles élevées à des températures élevées et des temps de réaction plus longs, nous avons exploré d'autres solvants de réaction à point d'ébullition élevé (Fig. 4E), notamment la N-méthyl-2-pyrrolidone (NMP), le 1,3-diméthyl-3,4,5 ,6-tétrahydro-2(1H)-pyrimidinone (DMPU) et l'éthylène glycol, qui ont été utilisés dans d'autres radiosynthèses44,45. L'efficacité de la fluoration et le RCY brut ont été significativement améliorés en utilisant la NMP par rapport au DMF. Comme test final, nous avons comparé l'influence du type de base et de catalyseur de transfert de phase (Fig. 4F) dans les solvants de réaction DMF, DMSO et NMP. La meilleure combinaison était NMP avec TBAHCO3 ; des performances bien inférieures ont été observées avec K222/K2CO3 et K222/Cs2CO3. Les conditions optimisées (solvant de réaction NMP, 240 nmol de base (TBAHCO3) et 280 nmol de précurseur dans une gouttelette de 8 µL à 200 °C pendant 0,5 min) ont entraîné une efficacité de fluoration de 37,5 ± 0,8 (n = 4), une efficacité de collecte de 51 ± 1 (n = 4) et RCY brut de 19,1 ± 0,6 % (n = 4). La purification par HPLC analytique (Section supplémentaire 9.1 ou un lot qui avait un RCY brut de 18,0 % a donné un rendement isolé de 11,6 % (n = 1). Une optimisation supplémentaire de la purification peut conduire à des améliorations modestes, mais n'a pas été étudiée. Notamment, le la synthèse à base de gouttelettes pourrait atteindre des rendements isolés utiles qui ne sont que légèrement inférieurs aux rendements isolés rapportés par d'autres (tableau supplémentaire S11) tout en offrant de multiples avantages, y compris l'achèvement en seulement ~ 35 min (20 min pour la synthèse et la purification HPLC, avec une estimation ~ 15 min nécessaires pour la formulation46) au lieu de 55 à 80 min 38,39,40 et 100 × consommation de précurseur réduite38,39,40.

Pour démontrer la polyvalence de l'approche à haut débit, nous avons ensuite utilisé la plateforme pour effectuer une optimisation de la radiosynthèse de [18F]PBR06. Ce traceur détecte l'activation microgliale en ciblant la protéine translocatrice (TSPO) et est utilisé pour surveiller la réponse au traitement dans la maladie de Huntington47, l'imagerie de la neuroinflammation et la progression tumorale48. En utilisant le précurseur de tosylate disponible dans le commerce pour la radiosynthèse, des rendements isolés de [18F]PBR06 compris entre 30 et 60 % ont été rapportés dans la littérature48,49 ; cependant, à notre connaissance, aucune étude n'a été rapportée sur l'influence des différentes conditions de réaction sur les performances de la radiosynthèse.

Les détails complets de tous les paramètres que nous avons explorés (quantité de précurseur, quantité de base, température, temps de réaction et type de catalyseur de transfert de base/phase) sont inclus dans la section supplémentaire. 6. Comme pour le [18F]flumazénil, des études de chaque paramètre ont été réalisées dans les deux solvants de réaction différents suivants : DMSO (couramment rapporté dans la littérature48,49) et un mélange 1:1 (v/v) d'alcool thexylique et de MeCN ( utilisé dans les radiofluorations aliphatiques d'autres précurseurs de tosylate33). Dans l'étude de la quantité de précurseur (Fig. 5A), les réactions dans le solvant mixte ont montré une efficacité de fluoration augmentant rapidement avec l'augmentation de la quantité de précurseur, atteignant un plateau d'environ 100% à ~ 100–200 nmol de précurseur, et l'efficacité de collecte était systématiquement haut. Le RCY brut résultant a augmenté rapidement à mesure que la quantité de précurseur a augmenté, atteignant un plateau de 91 ± 4 % (n = 4) à 160 nmol de précurseur. Fait intéressant, pour les réactions effectuées dans le DMSO, les tendances étaient similaires pour les quantités de précurseurs inférieures à ~ 100–200 nmol de précurseur, mais pour des quantités de précurseurs plus élevées, l'efficacité de la fluoration, l'efficacité de la collecte et le RCY brut ont montré une diminution progressive à modérée au lieu de se stabiliser. Pourtant, le RCY brut maximal en utilisant du DMSO (86 ± 6 %, n = 4) était similaire à celui obtenu en utilisant le solvant mixte.

Influence des paramètres de réaction sur les performances de la radiosynthèse de microgouttelettes de [18F]PBR06. Pour chaque paramètre, l'influence sur l'efficacité de la fluoration, l'efficacité de la collecte et le RCY brut sont tracés individuellement. (A) Effet de la concentration du précurseur (et du solvant). Volume de réaction : 8 µL. Quantité de base : 240 nmol. Temps de réaction : 5 min. Température de réaction 100°C. (B) Effet de la quantité de base (et de solvant). Quantité de précurseur : 160 nmol. Volume de réaction : 8 µL. Température de réaction : 100 °C. Temps de réaction : 5 min. (C) Effet de la température (et du solvant). Quantité de précurseur : 160 nmol. Volume de réaction : 8 µL. Quantité de base : 240 nmol. Temps de réaction : 5 min. (D) Effet du temps de réaction (et du solvant). Quantité de précurseur : 160 nmol. Volume de réaction : 8 µL. Quantité de base : 240 nmol. Température de réaction : 100°C. (E) Effet du type de base. Quantité de précurseur : 160 nmol. Volume de réaction : 8 µL. Quantité de base : 240 nmol. Température de réaction : 100°C. Temps de réaction : 0,5 min.

Dans les études sur la quantité de base (Fig. 5B), l'efficacité de la fluoration, l'efficacité de la collecte et le RCY brut n'étaient relativement pas affectés, ne montrant que de modestes réductions lorsque la quantité de base était inférieure à ~ 150 nmol. Le RCY brut était maximal à 240 nmol de base. Dans l'étude de la température de réaction (Fig. 5C), l'efficacité de la fluoration était relativement indépendante de la température lors de l'utilisation du solvant de réaction mixte. Lors de l'utilisation de DMSO, la fluoration était maximale entre 90 et 130 °C. L'efficacité de la collecte était constamment élevée à toutes les températures (et pour les deux solvants) et le RCY brut reflétait l'efficacité de la fluoration. Une température de 100 °C a été choisie. Le temps de réaction (Fig. 5D) n'a eu presque aucun impact, avec un RCY brut élevé dans tous les cas, sauf pour le DMSO à 0, 5 min, où le RCY brut était nettement inférieur. Enfin, nous n'avons trouvé aucune différence significative lors de l'utilisation de TBAHCO3 par rapport au catalyseur de transfert de phase généralement rapporté K222/K2CO3 lors de l'utilisation du solvant mixte ; cependant, lors de l'utilisation de DMSO comme solvant de réaction, l'efficacité de la fluoration et le RCY brut étaient légèrement inférieurs lors de l'utilisation de K222 / K2CO3 par rapport à TBAHCO3 (Fig. 5E). Les résultats pour le DMSO étaient globalement inférieurs en raison du temps de réaction sous-optimal utilisé dans cette comparaison.

Globalement, les conditions optimales (240 nmol de TBAHCO3, 160 nmol de précurseur dans 8 µL d'alcool thexylique : MeCN (1:1 v/v), 100 °C, 0,5 min) ont donné une efficacité de fluoration de 97,4 ± 0,2 % (n = 4) et RCY brut de 94 ± 2 % (n = 4). Par rapport aux méthodes conventionnelles (tableau supplémentaire S18, nos conditions optimales étaient significativement plus rapides (0,5 vs 15 min de temps de réaction)48 et plus douces (100 vs 140 °C)48. Nous avons effectué une purification par radio-HPLC à l'échelle analytique (Sect. supplémentaire 9.2) et obtenu un rendement isolé de 75,8 % (n = 1). Bien que nous n'ayons pas effectué de formulation pour déterminer le RCY global, cela se compare favorablement aux valeurs globales de RCY (30 - 60 %) rapportées dans la littérature48,49, consommé 10-30 × moins de précurseur48,49, et était un processus de synthèse plus court (~ 35 min, c'est-à-dire 20 min pour la synthèse et la purification HPLC, plus environ 15 min nécessaires pour la formulation46), par rapport aux 50 min rapportées dans la littérature49.

[18F]Fallypride est utilisé pour étudier les maladies associées au système dopaminergique, telles que les maladies de Parkinson, de Huntington et d'Alzheimer50,51. Nous avons précédemment effectué une étude préliminaire de la synthèse des gouttelettes de [18F]Fallypride à partir du précurseur de tosylate en explorant l'impact de la quantité de base, de la quantité de précurseur et du volume de réaction33. Cependant, avec un seul élément chauffant faisant fonctionner une seule puce, la température et le temps de réaction ne pouvaient auparavant pas être étudiés de manière pratique. En utilisant les capacités étendues de la plate-forme multi-chauffage décrite ici, nous avons étudié l'impact de la température et du temps de réaction en combinaison avec la concentration des précurseurs. Tous les détails sont dans la section supplémentaire. 7. En fonction de l'augmentation de la concentration des précurseurs, l'efficacité de la fluoration et le RCY brut présentent une augmentation rapide à partir de près de zéro et atteignent un plateau, tandis que l'efficacité de la collecte est constamment élevée (Figure supplémentaire S41). Étonnamment, un comportement presque identique a été observé pour des températures de réaction de 95, 110 et 125 °C ; mais à 80 ° C, il était évident qu'une concentration de précurseur plus élevée était nécessaire pour atteindre l'efficacité de fluoration maximale et le RCY brut (Figure supplémentaire S41A). Le RCY brut maximal s'est produit à 110 ° C et 39 mM de précurseur. Lors de l'examen de l'effet combiné de la concentration du précurseur et du temps de réaction (Figure supplémentaire S41B), l'impact du temps de réaction était presque négligeable, ne conduisant à des différences perceptibles que lorsque la concentration du précurseur était inférieure à ~ 20 mM. Le RCY brut le plus élevé (93 ± 5 %, n = 2) a été obtenu lors de l'exécution de la réaction à 110 °C pendant 1,0 min, 240 nmol de TBAHCO3 et 39 mM de précurseur dans 6 µL d'alcool thexylique : MeCN (1:1 v /v). Après purification par HPLC analytique (Sect. supplémentaire 9.3), le rendement isolé était de 74 % (n = 1). La possibilité d'effectuer une étude cinétique comme celle-ci dans un ensemble d'expériences simultanées est un avantage significatif par rapport à la longue série typique d'études séquentielles avec des instruments conventionnels ou des systèmes de chimie en flux microfluidique. Cette approche fournit probablement également des temps et des températures de réaction plus fiables que lors du refroidissement et de l'ouverture répétés d'une seule réaction pour extraire des échantillons à différents moments55.

Comme dernier exemple, nous avons effectué une optimisation très limitée de la synthèse de [18F]FEPPA, un radiopharmaceutique qui a été utilisé dans plusieurs contextes précliniques et cliniques ces dernières années56,57,58,59,60 pour examiner la surexpression de TSPO, qui est connu pour être associé à une variété de troubles neurodégénératifs. À l'aide de la plate-forme à haut débit pour explorer l'influence de la température (section supplémentaire 8), nous avons traduit la synthèse en format de gouttelettes pour tirer parti des avantages des réactions à petit volume. Nous avons commencé avec des conditions similaires aux études de gouttelettes passées pour d'autres traceurs utilisant des précurseurs de tosylate. Étant donné que les rapports de la littérature incluent une plage de concentration de précurseur de 9 à 45 mM56, 57, 58, 61, nous avons choisi une valeur initiale de 30 mM. En fonction de l'augmentation de la température (Figure supplémentaire S44), l'efficacité de la fluoration était d'environ 10 % à 60 °C et a fortement augmenté pour atteindre un plateau après 90 °C. L'efficacité de collecte était constamment élevée à toutes les températures, et le RCY brut résultant a montré une tendance similaire à l'efficacité de la fluoration. Le RCY brut le plus élevé (77 ± 2 %, n = 4) a été observé à une température de 110 °C pendant 2,0 min, précurseur 30 mM dans 8 µL d'alcool thexylique : solvant MeCN (1:1 v/v) et 240 nmol de base (TBAHCO3). Par rapport aux méthodes de la littérature (tableau supplémentaire S22), le temps de réaction est plus court (2 min contre 10 min56,57,58,61), la réaction des gouttelettes consomme 40 à 50 × moins de précurseur, et la synthèse globale est plus courte et a un rendement plus élevé56 ,57,58,61. Un lot a été purifié par HPLC à l'échelle analytique (Sect. Supplémentaire 9.4) et la fraction collectée a été diluée (1:3, v/v) avec du NaHCO3 9 mM pour produire une solution isotonique appropriée pour l'injection contenant 440 MBq [12 mCi], suffisant pour plusieurs études précliniques. La synthèse globale de 30 min avait un RCY de 67 % (n = 1).

Les expériences d'optimisation dans ce travail ont été réalisées avec ~ 14 MBq [0,38 mCi], où chaque réaction a souvent donné suffisamment de produit pour plusieurs scans de souris62,63. Néanmoins, nous voulions explorer si l'un des composés optimisés ([18F]PBR06) pouvait être mis à l'échelle à des niveaux cliniquement pertinents sans modifier les conditions de réaction autres que la quantité de radioactivité de départ. Nous avons précédemment signalé qu'une mise à l'échelle significative est possible pour [18F]Fallypride (7,2 GBq démontrés)31, ainsi que pour O-2-[18F]fluoroéthyl-L-tyrosine ([18F]FET) et [18F]Florbetaben (jusqu'à 0,8 GBq démontré pour chacun)32. Des expériences avec une activité de démarrage croissante jusqu'à 3,2 GBq (86 mCi) sont décrites dans la section supplémentaire. 10. Alors que le RCY brut a montré une légère réduction à mesure que l'activité de départ augmentait en raison d'une diminution de l'efficacité de la fluoration, les quantités finales après purification et formulation seraient encore suffisantes pour plusieurs doses cliniques.

Ces résultats renforcent la capacité d'optimiser les réactions à petite échelle à haut débit à l'aide de la plate-forme décrite ici, puis d'augmenter l'activité de départ pour augmenter le rendement d'une radiosynthèse de gouttelettes. En fait, l'activité de départ elle-même pourrait être modifiée en tant que paramètre de réaction et étudiée à haut débit en utilisant la plate-forme décrite dans cet article. Des études sont actuellement en cours dans notre laboratoire pour explorer plus en détail comment la mise à l'échelle influence la performance.

Avec la plate-forme présentée ici pour effectuer des radiosynthèses parallèles en format gouttelettes, nous avons pu étudier rapidement et facilement l'influence de divers paramètres de réaction pour obtenir une carte détaillée des conditions qui influencent les performances de synthèse. Chaque synthèse radiopharmaceutique pourrait être étudiée de manière approfondie (des centaines de points de données) en quelques jours, ne nécessitant que quelques lots de radio-isotopes. Au total, pour les quatre exemples de composés, 820 expériences ont été réalisées en 15 jours d'expérience, avec une moyenne de 55 réactions par jour. Alors que le nombre maximum d'expériences réalisées en une seule journée était de 64, il est probablement possible d'augmenter ce nombre à ~ 96. Le facteur limitant est l'ajout manuel fastidieux de réactifs, la collecte de produits bruts et la réalisation d'une analyse TLC. Une plate-forme automatisée pour l'expérimentation à haut débit est actuellement en cours de développement, ce qui pourrait résoudre ces problèmes et peut-être augmenter encore le débit de réaction tout en réduisant l'exposition aux rayonnements et le risque d'erreur humaine64. L'exécution de nombreuses réactions par jour permet d'économiser du temps total (et donc de la main-d'œuvre et d'autres coûts) pour l'optimisation et nécessite beaucoup moins de lots de radio-isotopes, ce qui réduit considérablement la production de radio-isotopes et/ou les coûts d'achat et d'expédition. Fait important, étant donné que les variations quotidiennes telles que la qualité des radio-isotopes ou la préparation des réactifs peuvent parfois également affecter les résultats65, la réduction du nombre total de jours expérimentaux (et de lots de radio-isotopes) réduit également les effets de confusion de cette variabilité. De plus, en utilisant des réactions de gouttelettes à petite échelle (c'est-à-dire 6 à 8 µL) par rapport aux réacteurs conventionnels (0,5 à 2,0 mL), l'utilisation de réactifs par point de données a été réduite d'environ 10 à 100 fois. La quantité totale de précurseur consommée n'était que de 30 mg pour 355 points de données pour le [18F]Flumazénil, 20 mg pour 296 points de données pour le [18F]PBR06, 6 mg pour 128 points de données pour le [18F]Fallypride et 4 mg pour 32 points de données. points pour [18F]FEPPA. Ces quantités sont équivalentes à seulement 12 réactions à grande échelle pour [18F]Flumazénil (5 mg chacun), 6 à 7 pour [18F]PBR06 (3 mg chacun), 3 pour [18F]Fallypride (2 mg chacun) et une pour [ 18F]FEPPA. De plus, la quantité d'activité du produit dans certains cas est suffisante pour des études d'imagerie in vitro ou précliniques in vivo. Cela pourrait être un énorme avantage pour le développement de nouveaux radiotraceurs où le précurseur est en pénurie. La plate-forme de gouttelettes permet de réaliser à la fois l'optimisation et les études biologiques préliminaires initiales dans les plus brefs délais en utilisant seulement quelques mg de précurseur.

Outre les radiosynthétiseurs conventionnels, des optimisations rapides et économiques ont également été réalisées à l'aide de plateformes microfluidiques à flux continu. De petits bolus de réactifs (10s de µL) sont mis à réagir séquentiellement dans différentes conditions20,66 (jusqu'à 25 expériences par jour ont été rapportées67). Bien que pratique pour étudier l'influence du temps de séjour, des concentrations et des ratios de réactifs (via des changements de débits relatifs) et de la température de réaction, la variation d'autres conditions (par exemple, le solvant) est lourde, nécessitant une intervention manuelle et des procédures de nettoyage pour chaque changement. De plus, certains aspects (par exemple, les conditions de séchage du fluorure [18F]) ne peuvent pas être explorés à haut débit car ils sont effectués en dehors du flux de travail de la chimie en flux. Les réacteurs à gouttelettes conviennent à l'étude de toutes ces variables et peuvent effectuer des réactions en parallèle plutôt que séquentiellement. Un avantage supplémentaire de l'optimisation à l'aide de réactions de gouttelettes est que la plate-forme multi-chauffage est compacte (120 × 120 × 100 mm3), permettant un fonctionnement dans une petite partie d'une cellule chaude ou d'une mini-cellule. Son faible poids (~ 900 g) rend le système portable et facile à déplacer dans et hors d'une cellule chaude et n'occupe de l'espace que lorsque des efforts d'optimisation sont nécessaires. En revanche, les radiosynthétiseurs conventionnels et les systèmes de chimie en flux sont généralement beaucoup plus grands et intégrés dans l'infrastructure (gaz, vide) et ne peuvent pas être facilement déplacés.

Une caractéristique unique du système de microgouttelettes ouvertes est la commodité de visualiser et de quantifier la distribution de la radioactivité sur la surface de la puce via l'imagerie Cerenkov à différentes étapes du processus de synthèse. Ces informations permettent une évaluation plus complète de la performance de chaque étape. Alors que certains systèmes à grande échelle comprennent des détecteurs de rayonnement à proximité des récipients de réaction et des cartouches qui permettent des mesures d'activité directes sur ces composants pour aider à identifier les pertes43, d'autres systèmes nécessitent le retrait/le démontage des composants pour effectuer des mesures d'activité, ce qui peut être impossible ou peu pratique et augmente l'exposition aux rayonnements. En comparaison, ces données peuvent être facilement recueillies en parallèle pour de nombreuses réactions à la fois dans notre approche à haut débit, ce qui permet de gagner un temps considérable, de réduire l'exposition aux rayonnements et de réduire les risques d'erreurs.

D'autre part, une limitation de cette approche est que le format de gouttelettes ouvertes présentait des pertes volatiles importantes pour certaines synthèses. Alors que les pertes volatiles étaient très faibles pour [18F]PBR06, [18F]Fallypride et [18F]FEPPA sous forme de gouttelettes (ainsi que de nombreux autres traceurs28,46,68), les pertes étaient importantes pour [18F]Flumazénil et se sont avérées se produisent lors de l'étape de radiofluoration. En revanche, dans les systèmes à grande échelle, le réacteur est généralement fermé pendant la durée de la réaction, et les pertes au cours de cette étape sont généralement susceptibles d'être inférieures. Bien sûr, les systèmes de gouttelettes et les systèmes conventionnels peuvent présenter des pertes volatiles à d'autres étapes du processus de radiosynthèse, comme lors des étapes d'évaporation du solvant. Malgré la perte volatile, des expériences significatives et reproductibles pourraient encore être réalisées. De plus, le rendement isolé du [18F] Flumazénil (qui présentait une perte volatile substantielle) n'était que légèrement inférieur à la plage de rendements isolés (avant formulation) rapportés par d'autres, ce qui suggère que la perte des espèces volatiles n'était pas très préjudiciable à la performance globale de la réaction. , ou peut-être que la perte de réaction a été compensée par d'autres améliorations (par exemple, peut-être que l'utilisation d'une colonne HPLC analytique au lieu d'une colonne HPLC semi-préparative a réduit le degré de perte de purification). Bien sûr, les pertes volatiles présentent un danger qui doit être atténué par le fonctionnement du système dans une cellule chaude appropriée.

Alors que les études ici ont été réalisées à l'aide d'une méthode une variable à la fois (OVAT), d'autres améliorations de l'efficacité de l'optimisation pourraient être obtenues en intégrant des concepts tels que la conception d'expériences (DoE)65 et la modélisation des réactions. En plus des réactions optimisées ici, le format de gouttelettes est compatible avec d'autres radiopharmaceutiques marqués au 18F28,29,46,69. Il peut probablement être utilisé avec d'autres isotopes, y compris les radiométaux. Bien que conçue pour fonctionner dans un laboratoire de radiochimie, la plate-forme pourrait également être utilisée pour l'optimisation économique en réactifs d'un large éventail de réactions chimiques en dehors du domaine de la radiochimie. Récemment, plusieurs nouvelles plates-formes et techniques ont été signalées pour effectuer le criblage de réactions organiques dans des volumes de 1,5 à 100 µL15,16, et notre plate-forme pourrait fournir une capacité améliorée à faire varier les températures et les temps de réaction pour différentes réactions simultanées.

Dans ce travail, nous avons développé une plate-forme d'optimisation de la radiosynthèse reposant sur des réseaux de réaction à base de gouttelettes qui permet de réaliser de nombreuses réactions (jusqu'à 64) en parallèle, chacune avec une consommation minimale de réactifs. Combiné avec des méthodes d'analyse à haut débit34, il est pratique de réaliser des centaines d'expériences en quelques jours. Bien que similaire en débit aux méthodes d'optimisation basées sur la chimie en flux70, cette plateforme permet d'étudier toutes les étapes du processus de synthèse, y compris le séchage/activation du [18F]fluorure, et il a été démontré dans des travaux antérieurs que les puces sont également compatibles avec l'optimisation. de réactions comportant au moins 2 étapes de synthèse29,46. Il permet également de varier facilement les quantités de solvant de réaction et de réactif sans les contraintes des systèmes basés sur le flux. Enfin, les quantités de produits peuvent être augmentées après optimisation en faisant varier l'activité de démarrage.

À titre d'exemples, nous avons utilisé la plate-forme pour effectuer l'optimisation rapide de la production de [18F]Flumazenil, [18F]PBR06, [18F]Fallypride et [18F]FEPPA à partir de leurs précurseurs disponibles dans le commerce. À l'aide de la plate-forme, une série de synthèses utilisant différentes conditions (85 pour [18F]Flumazénil, 74 pour [18F]PBR06, 64 pour [18F]Fallypride et 8 pour [18F]FEPPA), couvrant 6 paramètres de réaction différents, ont été réalisées. . Des études répétées ont été réalisées pour chaque condition et le petit écart type calculé pour chaque ensemble de répétitions a indiqué que la plate-forme a une reproductibilité élevée. Pour le [18F]Flumazénil, les tendances observées étaient comparables aux études d'optimisation réalisées à l'aide de radiosynthétiseurs conventionnels. Pour les autres traceurs, les données d'optimisation sont limitées dans la littérature.

Cette plate-forme apporte la puissance et l'efficacité de l'expérimentation à haut débit au domaine de la radiochimie. Il pourrait trouver une utilisation dans : (i) le raffinement et l'optimisation rapides des protocoles de radiosynthèse pour les produits radiopharmaceutiques existants ou nouveaux, (ii) la traduction de protocoles connus à grande échelle en format de gouttelettes et (iii) les études de nouvelles méthodes de marquage. La plate-forme à haut débit permet d'explorer de nombreuses autres conditions de réaction dans l'espace de paramètres disponible, ce qui peut potentiellement conduire à la découverte de conditions de réaction favorables qui ne pourraient autrement pas être tentées avec des méthodes conventionnelles en raison du temps, du coût et du faible débit. La petite quantité de précurseur requise pour chaque réaction est un avantage crucial, en particulier dans les premiers stades du développement d'un nouveau radiopharmaceutique où seule une petite quantité du matériau de départ peut être disponible ; la plate-forme à haut débit permet le développement de synthèses dans des délais courts à faible coût.

N,N-diméthylformamide anhydre (DMF, 99,8 %) acheté auprès de Fisher Scientific, diméthylsulfoxyde anhydre (DMSO, ≥ 99,9 %), acétonitrile anhydre (MeCN, 99,8 %), 2,3-diméthyl-2-butanol (alcool thexylique, 98 %), 4,7,13,16,21,24-hexaoxa-1,10-diazabicyclo[8.8.8]hexacosane (K222, 98 %), triéthylamine (TEA, 99 %), acide trifluoroacétique (TFA, > 99 %), tétrahydroflurane (THF, > 99,9 %, sans inhibiteur), hexanes (95 %), dichlorométhane (DCM, > 99,8 %), acétone (99,5 %), formiate d'ammonium (NH4HCO2 : 97 %) N-méthyl- 2-pyrrolidone (NMP, 99,5 % anhydre), 1,3-diméthyl-3,4,5,6-tétrahydro-2(1H)-pyrimidinone (DMPU, 98 %), éthylène glycol (99,8 %) et carbonate de potassium ( K2CO3, 99,995 %) ont été achetés chez Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Le n-butanol (nBuOH, 99%) a été acheté chez Alfa Aesar (Ward Hill, MA, USA). Bicarbonate de tétrabutylammonium (TBAHCO3, 75 mM dans l'éthanol), éthyl-5-méthyl-8-nitro-6-oxo-5,6-dihydro-4H-benzo[f]imidazo[1,5-a][1,4] diazépine-3-carboxylate (nitromazénil ; précurseur du [18F]flumazénil, > 97 %) et flumazénil (étalon de référence, > 99 %), 2-((2,5-diméthoxybenzyl)(2-phénoxyphényl)amino)-2- oxoéthyl-4-méthylbenzènesulfonate (précurseur du [18F]PBR06, > 95%), 2-fluoro-N-(2-méthoxy-5-méthoxybenzyl)-N-(2-phénoxyphényl)acétamide (étalon de référence pour le [18F]PBR06, > 95 %), (S)-2,3-diméthoxy-5-[3-[[4-méthylphényl)-sulfonyl]oxy]-propyl]-N-[[1-(2-propényl)-2-pyrrolidinyle ]méthyl]benzamide (précurseur de [18F]Fallypride, > 90 %), Fallypride (norme de référence, > 95 %), 2-(2-((N-4-phénoxypyridin-3-yl)acétamido)méthyl)phénoxy)éthyl -4-méthylbenzènesulfonate (précurseur de [18F]FEPPA, > 90 %) et N-[[2-(2-fluoroéthoxy)phényl]méthyl]-N-(4-phénoxypyridin-3-yl)acétamide (étalon de référence pour [ 18F]FEPPA, > 95 %) ont été achetés chez ABX Advanced Biochemical Compounds (Radeberg, Allemagne). L'eau DI a été obtenue à partir d'un système de purification d'eau Milli-Q (EMD Millipore Corporation, Berlin, Allemagne). Le [18F]fluorure sans support ajouté dans le [18O]H2O a été obtenu auprès de l'UCLA Ahmanson Biomedical Cyclotron Facility et de Crump Cyclotron Facility.

Une solution à 1 % de Téflon AF 2400 a été achetée chez Chemours. La résine photosensible positive (MEGAPOSIT SPR 220–7.0) et le révélateur (MEGAPOSIT MF-26A) ont été achetés auprès de MicroChem (Westborough, États-Unis). Solvants et produits chimiques supplémentaires utilisés pour la fabrication de puces microfluidiques, notamment le méthanol (MeOH, qualité Cleanroom LP), l'acétone (qualité Cleanroom LP), l'isopropanol (IPA, qualité Cleanroom LP), l'acide sulfurique (96 %, qualité MB Cleanroom) et le peroxyde d'hydrogène ( 30 %, qualité Cleanroom LP), ont été achetés auprès de KMG Chemicals (Fort Worth, États-Unis).

Les solutions mères suivantes ont été préparées quotidiennement pour effectuer des réactions de gouttelettes. La solution mère de fluorure de [18F] contenait soit 60 mM de TBAHCO3 et 1,8 MBq/μL (48 μCi/μL) de fluorure de [18F] dans l'eau (c'est-à-dire pour [18F]Flumazenil, [18F]PBR06, [18F]Fallypride et [ 18F]FEPPA), ou 60 mM de K222 avec 30 mM de K2CO3 et 1,8 MBq/μL (48 μCi/μL) de [18F]fluorure dans l'eau (c'est-à-dire pour [18F]Flumazénil et [18F]PBR06), ou 60 mM de K222 avec 30 mM de Cs2CO3 et 1,8 MBq/μL (48 μCi/μL) de [18F]fluorure dans l'eau (c'est-à-dire pour le [18F]Flumazénil). La solution mère de précurseur de [18F]flumazénil contenait 70 mM de précurseur dans du DMSO, du DMF, du NMP, du DMPU ou de l'éthylène glycol. La solution mère de précurseur de [18F]PBR06 contenait 70 mM de précurseur dans du DMSO ou un mélange 1:1 v/v d'alcool thexylique et de MeCN. La solution mère de [18F]Fallypride contenait 77 mM de précurseur dans un mélange 1:1 v/v d'alcool thexylique et de MeCN. La solution mère de [18F]FEPPA contenait 30 mM de précurseur dans un mélange 1:1 v/v d'alcool thexylique et de MeCN. Pour le [18F]flumazénil, la solution mère de collecte était un mélange 2:1 v/v de solvant de réaction et d'eau lors de l'utilisation de DMSO ou de DMF comme solvant de réaction, ou un mélange 9:1 v/v de solution mère de collecte MeOH et H2O lors de l'utilisation de NMP, de DMPU ou d'éthylène glycol comme solvant de réaction. Pour [18F]PBR06, [18F]Fallypride et [18F]FEPPA, la solution mère de collecte était un mélange 9:1 v/v de MeOH et H2O.

Les mesures de radioactivité ont été effectuées à l'aide d'un calibrateur de dose étalonné (CRC-25R, Capintec, Florham Park, NJ, USA). Pour calculer l'activité de départ sur chaque site de réaction, nous avons mesuré l'activité sur la puce après avoir chargé la solution initiale de fluorure [18F] sur chaque point individuel (via un calibrateur de dose) et soustrait la mesure précédente de l'activité de la puce. Toutes les mesures ont été corrigées pour la décroissance à un point de temps commun. L'efficacité de la collecte a été déterminée en divisant l'activité de l'échantillon brut collecté à partir d'un point individuel par l'activité de départ utilisée dans ce même site de réaction (corrigée pour la dégradation). L'efficacité de la fluoration a été analysée par radio-TLC. Le rendement radiochimique brut (RCY brut) a été calculé en multipliant l'efficacité de collecte par l'efficacité de fluoration. L'activité résiduelle totale laissée sur la puce a été mesurée en plaçant la puce dans un calibrateur de dose après collecte des produits bruts de chaque site de réaction. Pour calculer l'activité résiduelle laissée sur la puce à chaque site de réaction individuel, la distribution de l'activité sur les puces a d'abord été déterminée via l'imagerie Cerenkov33,68,71. Pour l'imagerie Cerenkov, une lame de microscope en verre (76,2 mm × 50,8 mm, 1 mm d'épaisseur ; C&A Scientific ; Manassas, VA, USA) a été placée au-dessus de la puce et le temps d'acquisition était de 5 min. Les images brutes ont été corrigées comme décrit précédemment34. L'activité résiduelle pour un site de réaction particulier sur la puce a été calculée à l'aide d'un logiciel d'analyse de région d'intérêt (ROI) personnalisé écrit en MATLAB (MathWorks, Natick, MA). Pour chaque site de réaction, une ROI a été tracée et le signal Cerenkov intégré a été calculé à partir de l'image. Pour quantifier la quantité d'activité résiduelle sur un site de réaction particulier, le signal intégré ROI correspondant a été divisé par la somme du signal intégré pour tous les ROI et multiplié par la radioactivité résiduelle totale mesurée sur la puce. Cette valeur pourrait ensuite être exprimée sous la forme d'une fraction de la radioactivité de départ en divisant l'activité résiduelle pour un site de réaction particulier par l'activité de départ utilisée sur ce site de réaction particulier (en corrigeant la décroissance).

L'exécution de 64 réactions simultanées présente un défi important pour l'analyse. Les méthodes typiques de repérage d'un échantillon par plaque TLC pour les longueurs et les conditions de plaques TLC généralement utilisées nécessitent 2 à 7 min par séparation et lecture d'échantillon et ne peuvent pas être pratiquement mises à l'échelle à 64 échantillons. Pour accélérer l'analyse, des plaques TLC (gel de silice 60 F254; Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne) ont été repérées avec plusieurs échantillons (8 échantillons au pas de 0,5 mm), tous les échantillons étant séparés en parallèle et lus simultanément via l'imagerie Cerenkov en utilisant des méthodes que nous ont déjà signalé34. En bref, 8 échantillons (0,5 μL chacun) ont été déposés sur une plaque TLC de 50 mm × 60 mm (l x L), les points adjacents étant séparés de 5 mm. Les plaques TLC développées ont été lues en recouvrant la plaque TLC avec une plaque de scintillateur (50 mm × 35 mm, 1 mm d'épaisseur, BC-400, Saint-Gobain, OH, USA) ou une lame de microscope en verre (76,2 mm × 50,8 mm, 1 mm d'épaisseur, A&C Scientific) pour obtenir des images de la lumière émise. Le front de solvant a mis environ 2 min pour parcourir 45 mm (correspondant à une distance de séparation de 30 mm). La phase mobile pour séparer l'échantillon brut de [18F]Flumazénil était 100 % MeCN, pour les échantillons bruts de [18F]PBR06 13:10:24:54 (v/v) dichlorométhane:chloroforme:acétone:hexanes comme phase mobile, pour [ Les échantillons bruts de 18F]FEPPA 25,6:37,5:36,5:0,4 (v/v) nBuOH:THF:hexanes:TEA comme phase mobile, et les échantillons bruts de [18F]Fallypride ont été séparés en utilisant 60 % de MeCN dans 25 mM de HN4HCO2 avec 1 % de TEA (v/v), comme indiqué précédemment33. Plus d'informations sur les valeurs Rf et les études de séparation TLC peuvent être trouvées dans la section supplémentaire. 4.

La radio-HPLC analytique a été utilisée pour identifier le produit de chaque synthèse (par co-injection avec l'étalon de référence) et pour isoler les produits purs afin de confirmer la valeur Rf des bandes de produits en radio-TLC. La configuration du système radio-HPLC comprenait un système HPLC Smartline (Knauer, Berlin, Allemagne) équipé d'un dégazeur (modèle 5050), d'une pompe (modèle 1000), d'un détecteur UV (254 nm ; Eckert & Ziegler, Berlin, Allemagne) et d'un gamma- détecteur de rayonnement et compteur (B-FC-4100 et BFC-1000 ; Bioscan, Inc., Poway, CA, USA). Toutes les séparations HPLC ont utilisé une colonne C18 Gemini (Kinetex, 250 × 4,6 mm, 5 µm, Phenomenex, Torrance, CA, USA). En utilisant une phase mobile de 3:1 H2O:MeCN avec 0,1 % de TFA (v/v) et un débit de 1,0 mL/min, le temps de rétention du [18F]Flumazénil était de 11 min. Pour [18F]PBR06, le temps de rétention était de 8 min en utilisant une phase mobile de 60:40 (v/v) MeCN: tampon phosphate de sodium 20 mM (pH = 5,8) avec un débit de 1,5 mL/min. Les échantillons de [18F]Fallypride ont été séparés avec une phase mobile de 60 % de MeCN dans 25 mM de HN4HCO2 avec 1 % de TEA (v/v) et un débit de 1,5 mL/min, ce qui a donné un temps de rétention de 4,5 min. Les échantillons de [18F]FEPPA ont été séparés avec une phase mobile de 70:30 v/v H2O:EtOH avec 0,1 % H3PO4 à 0,8 mL/min, donnant un temps de rétention de 15,5 min.

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Les auteurs remercient Roger Slavik, Giuseppe Carlucci et le personnel de l'UCLA Ahmanson Biomedical Cyclotron Facility pour avoir généreusement fourni du [18F]fluorure pour bon nombre de ces études. Nous remercions également Jeffrey Collins d'avoir produit le [18F]fluorure pour nos études ultérieures. Des substrats microfluidiques ont été produits dans la salle blanche UCLA Integrated NanoSystems (ISNC), et nous remercions le personnel pour son soutien technique. Ce travail a été soutenu en partie par le National Cancer Institute (R21 CA212718 et R33 CA240201), le National Institute of Mental Health (R44 MH097271), le National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (R21 EB024243 et T32 EB002101) et par l'UCLA Bourse Eugene Cota Robles (à AR).

Programme d'études supérieures interdépartementales de physique et de biologie en médecine, Université de Californie à Los Angeles (UCLA), Los Angeles, Californie, États-Unis

Alejandra Rios & R. Michael van Dam

Département de pharmacologie moléculaire et médicale, David Geffen School of Medicine, UCLA, Los Angeles, Californie, États-Unis

Travis S. Holloway et R. Michael van Dam

Département de bioingénierie, UCLA, Los Angeles, Californie, États-Unis

Philip H. Chao & R. Michael van Dam

Département de physique et d'astronomie, UCLA, Los Angeles, Californie, États-Unis

Christian De Caro

Institute for Society and Genetics, UCLA, Los Angeles, Californie, États-Unis

Chelsea C.Okoro

Crump Institute for Molecular Imaging, UCLA, Los Angeles, Californie, États-Unis

Alexandra Rios, Travis S. Holloway, Philip H. Chao, Christian De Caro, Chelsea C. Okoro et R. Michael van Dam

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AR a réalisé les expériences et analysé les données. TSH et CO ont aidé aux expériences. PHC a conçu l'appareil à haut débit, et AR et PHC ont assemblé et caractérisé le système. CD a fabriqué les puces de silicium multi-réaction. AR et RMV ont contribué à la conception expérimentale et ont rédigé le manuscrit. RMV a supervisé le projet. Tous les auteurs ont édité le manuscrit et approuvé la version finale.

Correspondance à R. Michael van Dam.

Le Dr van Dam est l'un des fondateurs de Sofie, Inc. et a reçu un soutien à la recherche pour certains aspects de ce projet via une sous-traitance de subvention fédérale. Les autres auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts.

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Réimpressions et autorisations

Rios, A., Holloway, TS, Chao, PH et al. Réseaux de réaction à l'échelle du microlitre pour une expérimentation économique à haut débit en radiochimie. Sci Rep 12, 10263 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-14022-2

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Reçu : 09 décembre 2021

Accepté : 31 mai 2022

Publié: 17 juin 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-14022-2

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